వార్తలు

IPTG (ఐసోప్రొపైల్-β-D-థియోగలాక్టోసైడ్) అనేది β-గెలాక్టోసిడేస్ సబ్‌స్ట్రేట్ యొక్క అనలాగ్, ఇది ఎక్కువగా ప్రేరేపించదగినది.IPTG యొక్క ఇండక్షన్ కింద, ప్రేరక అణచివేత ప్రోటీన్‌తో కాంప్లెక్స్‌ను ఏర్పరుస్తుంది, తద్వారా రెప్రెసర్ ప్రోటీన్ యొక్క ఆకృతి మార్చబడుతుంది, తద్వారా ఇది లక్ష్య జన్యువుతో కలపబడదు మరియు లక్ష్య జన్యువు సమర్థవంతంగా వ్యక్తీకరించబడుతుంది.కాబట్టి ప్రయోగం సమయంలో IPTG ఏకాగ్రతను ఎలా నిర్ణయించాలి?పెద్దది మంచిదా?
ముందుగా, IPTG ఇండక్షన్ సూత్రాన్ని అర్థం చేసుకుందాం: E. coli యొక్క లాక్టోస్ ఒపెరాన్ (మూలకం) Z,Y మరియు A అనే ​​మూడు నిర్మాణాత్మక జన్యువులను కలిగి ఉంటుంది, ఇవి వరుసగా β-గెలాక్టోసిడేస్, పెర్మీస్ మరియు ఎసిటైల్‌ట్రాన్స్‌ఫేరేస్‌లను ఎన్‌కోడ్ చేస్తాయి.lacZ లాక్టోస్‌ను గ్లూకోజ్ మరియు గెలాక్టోస్‌గా లేదా అల్లో-లాక్టోస్‌గా హైడ్రోలైజ్ చేస్తుంది;lacY వాతావరణంలోని లాక్టోస్ కణ త్వచం గుండా వెళుతుంది మరియు కణంలోకి ప్రవేశిస్తుంది;lacA ఎసిటైల్ సమూహాన్ని ఎసిటైల్-CoA నుండి β-గెలాక్టోసైడ్‌కి బదిలీ చేస్తుంది, ఇందులో టాక్సిక్ ఎఫెక్ట్‌ను తొలగించడం ఉంటుంది.అదనంగా, ఒక ఆపరేటింగ్ సీక్వెన్స్ O, ప్రారంభ శ్రేణి P మరియు రెగ్యులేటరీ జీన్ I ఉన్నాయి. I జన్యు కోడ్ అనేది రెప్రెసర్ ప్రొటీన్, ఇది ఆపరేటర్ సీక్వెన్స్ యొక్క స్థానం Oకి కట్టుబడి ఉంటుంది, తద్వారా ఒపెరాన్ (మెటా) అణచివేయబడుతుంది మరియు ఆపివేయబడింది.క్యాటాబోలిక్ జీన్ యాక్టివేటర్ ప్రొటీన్-CAP బైండింగ్ సైట్ ప్రారంభ శ్రేణికి అప్‌స్ట్రీమ్‌లో ఒక బైండింగ్ సైట్ కూడా ఉంది.జన్యు ఉత్పత్తుల యొక్క సమన్వయ వ్యక్తీకరణను సాధించడానికి మూడు ఎంజైమ్‌ల కోడింగ్ జన్యువులు ఒకే నియంత్రణ ప్రాంతంచే నియంత్రించబడతాయి.

లాక్టోస్ లేనప్పుడు, లాక్ ఒపెరాన్ (మెటా) అణచివేత స్థితిలో ఉంటుంది.ఈ సమయంలో, PI ప్రమోటర్ సీక్వెన్స్ నియంత్రణలో I సీక్వెన్స్ ద్వారా వ్యక్తీకరించబడిన లాక్ రెప్రెసర్ O సీక్వెన్స్‌తో బంధిస్తుంది, ఇది RNA పాలిమరేస్‌ను P సీక్వెన్స్‌కు బంధించకుండా నిరోధిస్తుంది మరియు ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ ఇనిషియేషన్‌ను నిరోధిస్తుంది;లాక్టోస్ ఉన్నప్పుడు, లాక్ ఒపెరాన్ (మెటా) ప్రేరేపించబడుతుంది ఈ ఒపెరాన్ (మెటా) వ్యవస్థలో, నిజమైన ప్రేరక లాక్టోస్ కాదు.లాక్టోస్ కణంలోకి ప్రవేశిస్తుంది మరియు అలోలాక్టోస్‌గా మార్చడానికి β-గెలాక్టోసిడేస్ ద్వారా ఉత్ప్రేరకమవుతుంది.తరువాతి, ఒక ప్రేరక అణువుగా, రెప్రెసర్ ప్రోటీన్‌తో బంధిస్తుంది మరియు ప్రోటీన్ కన్ఫర్మేషన్‌ను మారుస్తుంది, ఇది O సీక్వెన్స్ మరియు ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ నుండి రెప్రెసర్ ప్రోటీన్ యొక్క డిస్సోసియేషన్‌కు దారితీస్తుంది.ఐసోప్రొపైల్థియోగాలాక్టోసైడ్ (IPTG) అలోలాక్టోస్ వలె అదే ప్రభావాన్ని కలిగి ఉంటుంది.ఇది చాలా శక్తివంతమైన ప్రేరకం, ఇది బ్యాక్టీరియా ద్వారా జీవక్రియ చేయబడదు మరియు చాలా స్థిరంగా ఉంటుంది, కాబట్టి ఇది ప్రయోగశాలలలో విస్తృతంగా ఉపయోగించబడుతుంది.

IPTG యొక్క సరైన ఏకాగ్రతను ఎలా గుర్తించాలి?E. coliని ఉదాహరణగా తీసుకోండి.
సానుకూల రీకాంబినెంట్ pGEX (CGRP/msCT)ని కలిగి ఉన్న E. coli BL21 జన్యుపరంగా రూపొందించబడిన జాతి 50μg·mL-1 Amp కలిగిన LB ద్రవ మాధ్యమంలోకి చేర్చబడింది మరియు రాత్రిపూట 37°C వద్ద కల్చర్ చేయబడింది.పై సంస్కృతి విస్తరణ సంస్కృతి కోసం 1:100 నిష్పత్తిలో 50μg·mL-1 Amp కలిగి ఉన్న 50mL తాజా LB ద్రవ మాధ్యమం యొక్క 10 సీసాలలోకి టీకాలు వేయబడింది మరియు OD600 విలువ 0.6~0.8 ఉన్నప్పుడు, IPTG తుది సాంద్రతకు జోడించబడింది.ఇది 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1.అదే ఉష్ణోగ్రత వద్ద మరియు అదే సమయంలో ఇండక్షన్ తర్వాత, దాని నుండి 1 mL బ్యాక్టీరియా ద్రావణం తీసుకోబడింది మరియు బ్యాక్టీరియా కణాలను సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా సేకరించి, ప్రోటీన్ వ్యక్తీకరణపై వివిధ IPTG సాంద్రతల ప్రభావాన్ని విశ్లేషించడానికి SDS-PAGEకి లోబడి, ఆపై అతిపెద్ద ప్రోటీన్ వ్యక్తీకరణతో IPTG ఏకాగ్రతను ఎంచుకోండి.
ప్రయోగాల తర్వాత, IPTG యొక్క ఏకాగ్రత సాధ్యమైనంత పెద్దది కాదని కనుగొనబడుతుంది.IPTG బ్యాక్టీరియాకు కొంత విషపూరితం కావడమే దీనికి కారణం.ఏకాగ్రత దాటితే కణం కూడా నశిస్తుంది;మరియు సాధారణంగా చెప్పాలంటే, సెల్‌లో మరింత కరిగే ప్రోటీన్ వ్యక్తీకరించబడుతుందని మేము ఆశిస్తున్నాము, అయితే చాలా సందర్భాలలో IPTG యొక్క ఏకాగ్రత చాలా ఎక్కువగా ఉన్నప్పుడు, పెద్ద మొత్తంలో చేర్చడం ఏర్పడుతుంది.శరీరం, కానీ కరిగే ప్రోటీన్ మొత్తం తగ్గింది.అందువల్ల, చాలా సరిఅయిన IPTG ఏకాగ్రత తరచుగా పెద్దది కాదు, కానీ ఏకాగ్రత తక్కువగా ఉంటుంది.
జన్యుపరంగా ఇంజనీరింగ్ చేయబడిన జాతుల ఇండక్షన్ మరియు పెంపకం యొక్క ఉద్దేశ్యం లక్ష్యం ప్రోటీన్ యొక్క దిగుబడిని పెంచడం మరియు ఖర్చులను తగ్గించడం.లక్ష్య జన్యువు యొక్క వ్యక్తీకరణ జాతి యొక్క స్వంత కారకాలు మరియు వ్యక్తీకరణ ప్లాస్మిడ్ ద్వారా మాత్రమే కాకుండా, ప్రేరకం యొక్క ఏకాగ్రత, ఇండక్షన్ ఉష్ణోగ్రత మరియు ఇండక్షన్ సమయం వంటి ఇతర బాహ్య పరిస్థితుల ద్వారా కూడా ప్రభావితమవుతుంది.అందువల్ల, సాధారణంగా, తెలియని ప్రోటీన్ వ్యక్తీకరించబడటానికి మరియు శుద్ధి చేయబడటానికి ముందు, తగిన పరిస్థితులను ఎంచుకోవడానికి మరియు ఉత్తమ ప్రయోగాత్మక ఫలితాలను పొందడానికి ఇండక్షన్ సమయం, ఉష్ణోగ్రత మరియు IPTG ఏకాగ్రతను అధ్యయనం చేయడం ఉత్తమం.